2015药典 非无菌产品微生物限度检查：微生物限度检查 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。

微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于 B 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使 用中和剂或灭活剂的相容性。

计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称 MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微 生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。

供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数 方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能 够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。

菌种及菌液制备

试验用菌株的传代次数不得超过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌 种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学 特性。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表 1。

菌液制备 按表 1 规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单 胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物 加入 3～5ml 含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9% 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管 内，用含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯 化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 2～8℃，可在 24 小时内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮存期内使 用。

二、阴性对照

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验， 阴性对照试验应无 菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

培养基适用性检查 微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。

按表 1 规定，接种不大于 100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪 大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表 1 规定条件下培养。

每一试验菌株平行制备 2 管或 2 个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培 养基进行上述试验。

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在 0.5-2 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基 管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。

供试液制备 

根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液

制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过 45℃。供试液从制备至加入检验 用培养基,不得超过 1 小时。

常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应 建立其他适宜的方法。

⑴ 水溶性供试品 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。 若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

⑵ 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓 冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。 分散力较差的供试品，可在稀释剂中加入表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使 供试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将 供试液进一步 10 倍系列稀释。

⑶油脂类供试品 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少 量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯 80 或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分 混匀。表面活性剂的温度一般不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃）， 小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成 1∶10 供试液， 保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性 剂的稀释液进一步 10 倍系列稀释。

⑷需用特殊方法制备供试液的供试品

⒉ 接种和稀释
按下列要求进行供试液的接种和稀释,制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的 1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出， 首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。

（1） 试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每 1ml 供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于 100cfu。

（2） 供试品对照组 取制备好的供试液, 以稀释液代替菌液同试验组操作。

（3）菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试 液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理。如果 供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释 或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适应性试验。

⒊ 抗菌活性的去除或灭活

供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的 50%，可采用下 述方法消除供试品的抑菌活性。

⑴增加稀释液或培养基体积。

⑵加入适宜的中和剂或灭活剂。

⑶采用薄膜过滤法。

⑷上述几种方法的联合使用。 若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失败，表明供试品对该试验菌具有抗菌活性，同时也表明供试品不可能被该类微生物污染。但 是，供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。 因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果 判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法适用 性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供 试液进行供试品检查。

⒋ 供试品中微生物的回收

⑴ 平皿法 平皿法包括倾注法和涂布法。表 1 中每株试验菌每种培养基至 少制备 2 个平皿，以算术均值作为计数结果。

倾注法 取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的去除或灭 活”制备的供试液 1ml，置直径 90mm 的无菌平皿中, 注入 15～20ml 温度不超过 45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。 若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。按表 1 规定条件培养、计数。 同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。

涂布法 取 15～20ml 温度不超过 45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂 培养基，注入直径 90mm 的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养 基表面干燥。若使用直径较大的平皿，培养基用量也应相应增加。每一平板表面 接种上述照“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的去除或灭活”制备的供 试液不少于 0.1ml。按表 1 规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液 对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。

⑵ 薄膜过滤法 薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于 0.45μm,直径一 般为 50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。
选择滤膜材质时 应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适 宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前 先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分 干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤 膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一 般为 100ml。总冲洗量不得超过 1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

取照上述 “供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的去除或灭活”制备 的供试液适量（一般取相当于 1g、1ml 或 10cm2 的供试品, 若供试品中所含的菌 数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中,混匀,过滤。用适量的冲 洗液冲洗滤膜。

若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上； 若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。

按表 1 规定条件培养、计数。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

⑶ MPN 法 MPN 法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在 供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。若 使用 MPN 法，按下列步骤进行。

取照上述 “供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的去除或灭活”制备 的供试液至少 3 个连续稀释级，每一稀释级取 3 份 1ml 分别接种至 3 管装有 9～ 10ml 胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养基 中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。

接种管置 30～35℃培养 3 天，逐日观察各管微生物生长情况。如果由于供 试品的原因使得结果难以判断，可将该管培养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或 胰酪大豆胨琼脂培养基，在相同条件下培养 1～2 天，观察是否有微生物生长。 根据微生物生长的管数从表 3 查对被测供试品每 1g 或每 1ml 中需氧菌总数的最 可能数。

⒌ 结果判断

计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法或时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在 0.5～2 范围内；采用 MPN 法，试验组菌数应在菌液对照组菌数的 95%置信限内。若各试验菌的回收试 验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总 数、霉菌和酵母菌总数计数。

方法适用性确认时,若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不 到要求,那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。